Дядичкина О.В., Коротина О.Л., Радецкая Л.Е., Генералов И.И.
Возможности люминесцентной и световой микроскопии при определении внеклеточных нейтрофильных ловушек
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Республика Беларусь
Резюме.
Цель исследования – сравнить воспроизводимость результатов определения нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) при люминесцентной и световой микроскопии с использованием ДНК-селективных красителей.
Материал и методы. Материалом для исследования явились нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови у женщин с физиологическим течением беременности во 2 и 3 триместрах гестации. Произведена оценка их способности образовывать нейтрофильные внеклеточные ловушки в спонтанном (инкубация 180 минут с физиологическим раствором) и стимулированном (инкубация 180 минут со Staphylococcus aureus) вариантах с микроскопической оценкой результатов.
Результаты. Проведен анализ воспроизводимости результатов различных вариантов микроскопии и окраски фиксированных мазков при определении спонтанного и стимулированного уровней образования нейтрофильных внеклеточных ловушек. Были использованы высокочувствительные флуоресцентные красители Sytox Green, DAPI, акридиновый оранжевый и Hoechst 33342. После обработки последними лейкоциты и ДНК ловушки определяли с помощью люминесцентной микроскопии с использованием соответствующих источников излучения и наборов светофильтров. Для световой микроскопии применяли краситель метиловый зеленый. Оптимальным флуоресцентным красителем для определения нейтрофильных внеклеточных ловушек явился Hoechst 33342. Результаты, полученные при люминесцентной микроскопии с использованием Hoechst 33342 и световой микроскопии с красителем метиловый зеленый, статистически не отличались.
Заключение. Световая микроскопия с использованием красителя метиловый зеленый не уступает люминесцентной микроскопии с применением красителя Hoechst 33342 для определения нейтрофильных внеклеточных ловушек и может быть использована в лабораториях любого уровня.
Ключевые слова: нейтрофильные внеклеточные ловушки, врожденный иммунитет, люминесцентная микроскопия, световая микроскопия, Hoechst 33342, метиловый зеленый.
Литература
1. Gura, T. Innate immunity: ancient system gets new respect / T. Gura // Science. – 2001 Mar. – Vol. 291, N 5511. – P. 2068–2070.
2. Долгушин, И. И. Нейтрофилы и гомеостаз / И. И. Долгушин, О. В. Бухарин. – Екатеринбург : Изд-во УрОРАН, 2001. – 256 с.
3. Пинегин, Б. В. Нейтрофилы: структура и функция / Б. В. Пинегин, А. Н. Маянский // Иммунология. – 2007. – № 6. – С. 374-382.
4. Neutrophil extracellular traps kill bacteria / V. Brinkmann [et al.] // Science. – 2004 Mar. – Vol. 303, N 5663. – Р. 1532–1535.
5. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis / A. Hakkim [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010 May. – Vol. 107, N 21. – P. 9813–9818.
6. Cytokine-associated neutrophil extracellular traps and antinuclear antibodies in Plasmodium falciparum infected children under six years of age / V. S. Baker [et al.] // Malar J. – 2008 Feb. – Vol. 7. – P. 41.
7. Extracellular neutrophil traps in periodontitis / L. Vitkov [et al.] // Journal of Periodontal Research. – 2009 Oct. – Vol. 44, N 5. – P. 664-672.
8. Fuchs, T. A. Neutrophil extracellular trap (NET) impact on deep vein thrombosis / T. A. Fuchs, A. Brill, D. D. Wagner // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2012 Aug. – Vol. 32, N 8. – P. 1777–1783.
9. Neutrophil nets in reproduction: from Infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss / S. Hahn [et al.] // Front Immunol. – 2012 Nov. – Vol. 3. – P. 362.
10. Долгушин, И. И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И. И. Долгушин, Ю. С. Андреева, А. Ю. Савочкина. – М. : РАМН, 2009. – 208 c.
11. Kurnick, N. B. Methyl green-pyronin; stoichiometry of reaction with nucleic acids / N. B. Kurnick, A. E. Mirsky // J. Gen. Physiol. – 1950 Jan. – Vol. 33, N 3. – P. 265–274.
12. Kurnick, N. B. Methyl green. III. Reaction with desoxyribonucleic acid, stoichiometry, and behavior of the reaction product / N. B. Kurnick, M. Foster // J. Gen. Physiol. – 1950 Nov. –Vol. 34, N 2. – P. 147–159.
13. Colorimetric determination of DNase I activity with a DNA-methyl green substrate / D. Sinicropi [et al.] // Anal. Biochem. – 1994 Nov. – Vol. 222, N 2. – P. 351–358.
14. Peters, D. L. A method of DNA quantitation for localization of DNA in metrizamide gradients / D. L. Peters, M. E. Dahmus // Anal. Biochem. – 1979 Mar. – Vol. 93, N 2. – P. 306-311.
15. Johnson, I. D. The molecular probes handbook : a guide to fluorescent probes and labeling technologies / I. D. Johnson, Michelle T.Z. Spence. – 11th ed. – Life Technologies Corporation, 2010. – 1060 p.
Сведения об авторах:
Дядичкина О.В. – аспирант кафедры акушерства и гинекологии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»;
Коротина О.Л. – аспирант кафедры клинической микробиологии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»;
Радецкая Л.Е. – д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»;
Генералов И.И. – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой клинической микробиологии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет».
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210023, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра акушерства и гинекологии. Тел.раб.: +375 (212) 55-07-72, e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. – Дядичкина Ольга Васильевна.
